胰蛋白酶細胞消化液的活性測定和抑肽酶對胰蛋白酶的抑制

一、實驗目的

1.測定sigma公司的trypsin-EDTA細胞消化液的活性。

2.用重組抑肽酶抑制trypsin-EDTA細胞消化液中trypsin活性達完全所需的抑肽酶的量。

二、實驗材料

1) Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml  Lot # SLBN6048V  EXP Aug 17, 0.25%, sterile filtered,BioReagent, suitable for cell culture, 2.5g porcine trypsin and 0.2g EDTA per liter ofHank’s Balanced Salt Solution with phenol red.

2) RTI (recombinant aprotinin) Lot # 160301 ,  5.8 EPU/mg, 21.9mg/ml。

3) 活性測定底物：BAEE溶液，按照公司標準方法配置。

4) 胰蛋白酶活性測定方法，按照公司標準方法操作。

三、實驗過程及結果

1) 測定trypsin-EDTA solution的活性：4150 BAEE unit/ml,

2) 按照1EPU RTI可抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性，

計算完全抑制4150 BAEE unit/ml胰蛋白酶的RTI用量為 4150/16200=0.256 EPU。

四、具體實驗如下

2.1. 取150ul trypsin-EDTA solution，總活性為622.5 BAEE unit (4150 BAEE unit/ml * 0.15)，

2.2. 計算完全抑制，所需加入RTI的體積，622.5/16200=0.0384 EPU，換算為體積為：0.0384/(5.8*21.9)=0.302ul，將RTI稀釋10倍后，加入量為3.02 ul。

反應5min后，測定胰蛋白酶活性。

無活性。

結論：完全抑制

2.3. 計算50%抑制所需的加入量為1.51ul。 其他操作同2.2。

反應5min后，測定胰蛋白酶活性。

測定活性：2100BAEE unit/ml。

結論：抑制率為49.39%。

五、結論

1）1EPU RTI可完全抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性，若不完全抑制，則抑制率與加入的RTI的量成正比。

2）按照胰蛋白酶活性加入RTI (aprotinin)的量。

3）Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml  Lot # SLBN6048V的活性為4150 BAEE/ml，

若達到完全抑制，每ml中加入aprotinin的量為0.256 EPU。

加入一半量的aprotinin，可抑制一半的胰蛋白酶活性。