胰蛋白酶細胞消化液的活性測定和抑肽酶對胰蛋白酶的抑制
一、實驗目的
1.測定sigma公司的trypsin-EDTA細胞消化液的活性。
2.用重組抑肽酶抑制trypsin-EDTA細胞消化液中trypsin活性達完全所需的抑肽酶的量。
二、實驗材料
1) Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml Lot # SLBN6048V EXP Aug 17, 0.25%, sterile filtered,BioReagent, suitable for cell culture, 2.5g porcine trypsin and 0.2g EDTA per liter ofHank’s Balanced Salt Solution with phenol red.
2) RTI (recombinant aprotinin) Lot # 160301 , 5.8 EPU/mg, 21.9mg/ml。
3) 活性測定底物:BAEE溶液,按照公司標準方法配置。
4) 胰蛋白酶活性測定方法,按照公司標準方法操作。
三、實驗過程及結果
1) 測定trypsin-EDTA solution的活性:4150 BAEE unit/ml,
2) 按照1EPU RTI可抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性,
計算完全抑制4150 BAEE unit/ml胰蛋白酶的RTI用量為 4150/16200=0.256 EPU。
四、具體實驗如下
2.1. 取150ul trypsin-EDTA solution,總活性為622.5 BAEE unit (4150 BAEE unit/ml * 0.15),
2.2. 計算完全抑制,所需加入RTI的體積,622.5/16200=0.0384 EPU,換算為體積為:0.0384/(5.8*21.9)=0.302ul,將RTI稀釋10倍后,加入量為3.02 ul。
反應5min后,測定胰蛋白酶活性。
無活性。
結論:完全抑制
2.3. 計算50%抑制所需的加入量為1.51ul。 其他操作同2.2。
反應5min后,測定胰蛋白酶活性。
測定活性:2100BAEE unit/ml。
結論:抑制率為49.39%。
五、結論
1)1EPU RTI可完全抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性,若不完全抑制,則抑制率與加入的RTI的量成正比。
2)按照胰蛋白酶活性加入RTI (aprotinin)的量。
3)Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml Lot # SLBN6048V的活性為4150 BAEE/ml,
若達到完全抑制,每ml中加入aprotinin的量為0.256 EPU。
加入一半量的aprotinin,可抑制一半的胰蛋白酶活性。
