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          首頁    ELISA KIT    重組胰蛋白酶酶聯免疫吸附測定試劑盒 使用說明書 (96T)K02-RPT
          重組羧肽酶B

          重組胰蛋白酶酶聯免疫吸附測定試劑盒 使用說明書 (96T)K02-RPT

          重組胰蛋白酶酶聯免疫吸附測定試劑盒

          使用說明書

          96T)

          使用前請仔細閱讀說明書和提示部分。若有任何問題,請聯系我們。

                        

          1.試劑盒用途

          本試劑盒用于體外定量檢測待測樣品中重組胰蛋白酶含量。本試劑盒僅供研究和工業生產使用。

           

          2.試劑盒基本參數

          靈敏度:= 0.049 ng/ml

          檢測范圍:0.078 - 40 ng/ml

          特異性:可檢測重組胰蛋白酶,與其它重組大腸菌表達系統相關蛋白無明顯交叉反應。

          重復性:板內,板間變異系數均 < 10%。

          工作時間:熟練實驗人員可在2.5小時內完成一次測定。

          有效期:6個月

           

          3.試劑盒組成及保存

          未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒,請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。

          酶標板和標記抗體(A2)置于-20℃保存,隨用隨取,切勿室溫平衡。

           

           

           

          中文名稱

          規格

          保存條件

          凍干標準品 (A1)

          10ng/支×4

          2-8

          濃縮標準品 & 樣品稀釋液 &

          HRP-抗體稀釋液25 X(P1)

          1瓶×5 mL

          2-8

          濃縮洗滌液(25 X(P2)

          1瓶×40 mL

          2-8

          底物稀釋液(TMB(P3) 

          1瓶×15 mL

          2-8℃避光

          反應終止液 (P4)

          1瓶×5 mL

          2-8

          抗體包被的ELISA酶標板(96孔,可拆卸)

          8孔×12

          -20

          濃縮辣根過氧化物酶化抗體 (A2)

          1支×0.05 mL

          -20

          顯色底物(TMB(A3)

          5支×0.125 mL

          -20℃避光

          封板覆膜(可重復使用)

          5

           

          產品說明書

          1

           

          質檢報告

          1

           

           

           

          說明:

          1、所有試劑瓶須旋緊瓶蓋以防止蒸發和微生物污染。

          2、酶標板-20℃可存放6個月,2-8℃存放勿超過一周。

           

           

          4.試驗所需自備物品

          1. 酶標儀(濾光片組波長450 nm,參考波長650nm

          2. 高精度移液器,EP及一次性吸頭、一次性加樣槽

          3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水

          4. 潔凈無紙屑的吸水紙或干布

           

          5.待測樣品注意事項

          1.樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于2-8℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內檢測),或 -80℃(3個月內檢測),避免反復凍融。

          2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍,如果樣品中檢測物濃度高于標準品最高值,請根據實際情況,做適當倍數稀釋后再測。

          3.若使用化學裂解液制備的樣本或細胞提取液,由于引入某些化學物質會導致ELISA測值出現偏差。

           

          6.檢測前準備工作

          HRP標記抗體應始終置于-20℃保存,請勿室溫平衡,隨用隨取。

          請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒平衡至室溫,觀察溶液是否有結晶,如果有結晶按提示進行操作。提前15分鐘打開酶標儀預熱。

          ②稀釋液配制

          濃縮標準品&樣品稀釋液&HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋(125)。

          ③洗滌液配制

          濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(125)。

          提示:從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?,F象,可用40℃水浴加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過50℃,使用時洗滌液溫度應為室溫)。請當日使用。

          ④標準品配制

          將標準品于1000轉/分離心1分鐘后,加入標準品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標準品中,旋緊管蓋,靜置10分鐘后上溫和顛倒數次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為10 ng/mL, 然后進行倍比稀釋(注:不要直接在反應孔中進行倍比稀釋)。使用者可以根據實驗需要稀釋所需的濃度梯度配置。建議配制成以下濃度:10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/mL。

          提示:溶解和稀釋標準品過程中盡量避免產生氣泡。

          倍比稀釋方法

          7EP管,每管加入500 μL標準品&樣品稀釋液,從10 ng/mL的標準品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL標準品&樣品稀釋液EP管中混勻配成5 ng/mL的標準品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。

          標準品稀釋圖例(以500 μL為例)

          提示:最后一管直接作為空白孔,不再加入標準品工作液。

           

          HRP標記抗體工作液配制 

          HRP標記抗體應始終置于-20℃保存,請勿室溫平衡,隨用隨取。實驗前請先將抗體管低速離心,以避免管壁及管蓋上殘留抗體。實驗前計算實驗所需用量(以100μL /孔計算),實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘,用抗體稀釋液將HRP-標記抗體稀釋為工作濃度(抗體:稀釋液 = 1250)。當日使用。

          TMB顯色工作液配制

          實驗前計算實驗所需用量(以100μL /孔計算)。實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘平衡底物和緩沖液,加樣前底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度(底物:稀釋液 =120),現用現配。

          注:底物加入顯色緩沖液混勻后,若觀察顯色液變藍切勿加樣,說明可能有污染,請更換潔凈器皿。

           

          7.洗滌方法

          ①自動洗板機:每孔加入洗滌液350 μL, 注入和吸出間隔60秒。

          ②手工洗板:甩盡孔內液體,在潔凈厚吸水紙(或干布)上拍干,每孔加入洗滌液350 μL(此處也可以用潔凈洗瓶進行沖洗),浸泡5分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉板內液體,在潔凈厚吸水紙上拍干。

          提示:推薦使用洗瓶沖洗。若使用排槍,加樣槽請不要與其他試劑混用,避免污染。

           

          8.操作步驟

          將標準品工作液依次加入到前兩列孔中,每個濃度的工作液并列加兩孔,每孔100μL。待測樣品加入到其他孔,每孔100μL,若樣本濃度高于檢測范圍,需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。

          提示:加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,避免產生氣泡。加樣時間控制在10分鐘內。濃度由低到高依次加入。

          ②洗滌:棄去液體,甩干,在潔凈厚吸水紙上拍干。每孔加入洗滌液350 μL,浸泡5分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉板內液體,在潔凈厚吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。

          ③每孔中加入HRP-抗體工作液100 μL,混勻,酶標板覆膜并置于37℃孵育30分鐘。

          ④洗滌:用洗滌液洗板3次,每次洗滌5-10分鐘。

          ⑤每孔加底物顯色工作液(TMB100 μL,酶標板覆膜并置于37℃條件下孵育10分鐘。

          提示

          1)推薦使用排槍及加樣槽加入顯色液及終止液,盡量縮小由于加樣時差造成的顯色差異。

          2)根據實際顯色情況酌情縮短或延長,顯色時間在5-30分鐘范圍內。當標準孔出現明顯梯度時,即可終止。

          每孔加終止液50 μL,終止反應,室溫放置1分鐘。

          提示: 終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍槍頭切不要接觸孔內溶液以避免污染,影響實驗結果。

          用酶標儀在450 nm波長(參考波長650nm)測量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。

          提示: 請提前打開酶標儀電源,預熱儀器,設置檢測程序。

           

          9.結果判斷

          ①計算每組復孔的平均OD值。每個標準品的平均OD值減去空白孔的OD值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標(X),OD值為縱坐標(Y),繪出標準曲線(作圖時亦可去掉空白組的值)。

          ②推薦使用專業的曲線制作軟件,如curve expert 1.3ELISA Calc(請使用Logistic五參數擬合曲線計算方法繪制標準曲線)等。

          ③若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測。

          ④典型數據

          由于實驗操作條件的不同(如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等),標準曲線的OD值會有所差異。以下數據和曲線僅供參考實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

           

           X-濃度(ng/mL

          10

          5

          2.5

          1.25

          0.625

          0.312

          0.156

          0

          Y-OD450/650 nm

          1.601

          1.454

          1.231

          0.872

          0.624

          0.382

          0.244

          0.057

          Y-OD450/650 nm

          (去本底)

          1.574

          1.397

          1.174

          0.815

          0.567

          0.325

          0.187

          0

          回收量

          ng/mL

          10.167

          4.822

          2.628

          1.182

          0.657

          0.306

          0.153

          回收率%

          101.7

          96.4

          105.1

          94.6

          105.1

          98.1

          98.1

           

            

           

          10.注意事項

          1.儲存:試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發和微生物污染,否則可能會出現錯誤結果。

          酶標板、標記抗體、TMB底物應始終在-20℃保存,隨用隨取,無需平衡。

          2.酶標板:剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質,此為正?,F象,不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用板條應拆下后放入備用自封袋,按推薦溫度存放。

          3.加樣:加樣和加同一試劑時,第一孔與最后孔之間加樣時間間隔過大將導致不同的“預溫育”時間,從而明顯的影響到測量值的準確性及重復性,每次的加樣時間最好控制在10分鐘之內,推薦設置復孔。

          4.溫育:為防止樣品蒸發,實驗時必須給酶標板覆膜,洗板后應盡快進行下步操作,避免酶標板處于干燥狀態。嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

          5.洗板:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙或干布上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。讀數前要清除酶標板底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標儀讀數。

          6.試劑配制:試劑盒在運輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用1000/分離心一分鐘,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。所有試劑請按說明書指示請精確配制。

          7.顯色時間的控制:加入底物后,請定時觀察反應孔的顏色變化(比如每隔五分鐘),如梯度已經很明顯,請提前加終止液終止反應,以避免顏色過深,影響酶標儀讀數。

          8.底物:請避光保存底物。在儲存和溫育時,避免強光直接照射。

          9.混勻:充分輕微混勻對反應結果尤為重要,最好使用微量振蕩器,使用最低頻率,如無微量振蕩器,可以在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

          提示不同批號的試劑盒組分不能混用(洗滌液和終止液除外)。

          10.關于樣品回收率

          1)本試劑盒以測定重組豬胰蛋白酶的抗原性而非活力來推測殘留量,因此試劑盒中標準品采用胰蛋白酶的消光系數(E1%1cm=13.6D, 即當A280nm=1.36時,胰蛋白酶濃度為1mg/ml)來計算其蛋白含量,以最大限度保持質控的精確和穩定性。

          2)不同計量方法以及產品純度的差別可以導致不同來源、不同批次產品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致,也會造成回收率的差異。

          3)為避免上述因素影響,建議將用作回收率測試的樣品采用分光光度法(A280nm)估

          算蛋白含量,再稀釋至適合的濃度用于回收率測試,盡量減少回收率的誤差。

           

          11.問題分析

          若實驗結果有問題,請及時對顯色結果拍照,并妥善保存未使用板條及試劑,然后聯系

          技術支持。也可參考以下信息以找出原因。

           

          問題描述

          可能原因

          相應對策

          標準曲線梯度差

          吸液或加液不準

          檢查移液器和吸頭

          標準品稀釋不正確

          溶解標準品時稍微旋轉瓶身,輕輕混勻使粉末完全溶解

          酶標板洗滌不完全

          保證洗滌時間和洗滌次數及每孔的加液量

          顯色很弱或無色

          溫育時間太短

          保證充足的溫育時間

          實驗溫度不正確

          使用推薦的實驗溫度

          試劑體積不夠或漏加

          檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加

          稀釋不正確

          讀數數值低

          酶標儀設置不正確

          在酶標儀上檢查波長和濾光片裝置

          提前打開酶標儀預熱

          變異系數大

          加液不正確

          檢查加液情況

          背景值高

          檢測抗體的工作濃度過高

          使用推薦的稀釋倍數

          酶標板洗滌不完全

          重新仔細閱讀操作步驟,保證每步清洗完全;如果用自動洗板機,請檢查所有的出口是否有堵塞;是否使用試劑盒配備的洗滌液。

          洗液有污染

          配制新鮮的洗液

          靈敏度低

          ELISA試劑盒保存不當

          按說明書要求保存相關試劑

          讀數前未終止

          OD讀數前應在每孔中加入終止液

           

          • 產品規格
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