重組胰蛋白酶酶聯免疫吸附測定試劑盒 使用說明書 （96T）K02-RPT

重組胰蛋白酶酶聯免疫吸附測定試劑盒

使用說明書

（96T）

使用前請仔細閱讀說明書和提示部分。若有任何問題，請聯系我們。

              

1.試劑盒用途

本試劑盒用于體外定量檢測待測樣品中重組胰蛋白酶含量。本試劑盒僅供研究和工業生產使用。

 

2.試劑盒基本參數

靈敏度：= 0.049 ng/ml

檢測范圍：0.078 - 40 ng/ml

特異性：可檢測重組胰蛋白酶，與其它重組大腸菌表達系統相關蛋白無明顯交叉反應。

重復性：板內，板間變異系數均 < 10%。

工作時間：熟練實驗人員可在2.5小時內完成一次測定。

有效期：6個月

 

3.試劑盒組成及保存

未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒，請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。

酶標板和標記抗體（A2）置于-20℃保存，隨用隨取，切勿室溫平衡。

 

 

 

中文名稱	規格	保存條件
凍干標準品 (A1)	10ng/支×4支	2-8℃
濃縮標準品 & 樣品稀釋液 & HRP-抗體稀釋液（25 X）(P1)	1瓶×5 mL	2-8℃
濃縮洗滌液（25 X）(P2)	1瓶×40 mL	2-8℃
底物稀釋液（TMB）(P3)	1瓶×15 mL	2-8℃避光
反應終止液 (P4)	1瓶×5 mL	2-8℃
抗體包被的ELISA酶標板（96孔，可拆卸）	8孔×12條	-20℃
濃縮辣根過氧化物酶化抗體 (A2)	1支×0.05 mL	-20℃
顯色底物（TMB）(A3)	5支×0.125 mL	-20℃避光
封板覆膜（可重復使用）	5張
產品說明書	1份
質檢報告	1份

 

 

說明:

1、所有試劑瓶須旋緊瓶蓋以防止蒸發和微生物污染。

2、酶標板-20℃可存放6個月，2-8℃存放勿超過一周。

 

 

4.試驗所需自備物品

1. 酶標儀（濾光片組波長450 nm，參考波長650nm）

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭、一次性加樣槽

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4. 潔凈無紙屑的吸水紙或干布

 

5.待測樣品注意事項

1.樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或 -80℃（3個月內檢測），避免反復凍融。

2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋后再測。

3.若使用化學裂解液制備的樣本或細胞提取液，由于引入某些化學物質會導致ELISA測值出現偏差。

 

6.檢測前準備工作

HRP標記抗體應始終置于-20℃保存，請勿室溫平衡，隨用隨取。

①請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒平衡至室溫，觀察溶液是否有結晶，如果有結晶按提示進行操作。提前15分鐘打開酶標儀預熱。

②稀釋液配制

將濃縮標準品&樣品稀釋液&HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋（1：25）。

③洗滌液配制

將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1：25）。

提示：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F象，可用40℃水浴加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液溫度應為室溫）。請當日使用。

④標準品配制

將標準品于1000轉/分離心1分鐘后，加入標準品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘后上下溫和顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為10 ng/mL）, 然后進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。使用者可以根據實驗需要稀釋所需的濃度梯度配置。建議配制成以下濃度：10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/mL。

提示：溶解和稀釋標準品過程中盡量避免產生氣泡。

倍比稀釋方法

取7只EP管，每管加入500 μL標準品&樣品稀釋液，從10 ng/mL的標準品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL標準品&樣品稀釋液的EP管中混勻配成5 ng/mL的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。

標準品稀釋圖例（以500 μL為例）

提示：最后一管直接作為空白孔，不再加入標準品工作液。

 

⑤HRP標記抗體工作液配制 

HRP標記抗體應始終置于-20℃保存，請勿室溫平衡，隨用隨取。實驗前請先將抗體管低速離心，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。實驗前計算實驗所需用量（以100μL /孔計算），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，用抗體稀釋液將HRP-標記抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1：250）。當日使用。

⑥TMB顯色工作液配制

實驗前計算實驗所需用量（以100μL /孔計算）。實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘平衡底物和緩沖液，加樣前底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液 =1：20），現用現配。

注：底物加入顯色緩沖液混勻后，若觀察顯色液變藍切勿加樣，說明可能有污染，請更換潔凈器皿。

 

7.洗滌方法

①自動洗板機：每孔加入洗滌液350 μL， 注入和吸出間隔60秒。

②手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈厚吸水紙（或干布）上拍干，每孔加入洗滌液350 μL（此處也可以用潔凈洗瓶進行沖洗），浸泡5分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉板內液體，在潔凈厚吸水紙上拍干。

提示：推薦使用洗瓶沖洗。若使用排槍，加樣槽請不要與其他試劑混用，避免污染。

 

8.操作步驟

①將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100μL，若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。

提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產生氣泡。加樣時間控制在10分鐘內。濃度由低到高依次加入。

②洗滌：棄去液體，甩干，在潔凈厚吸水紙上拍干。每孔加入洗滌液350 μL，浸泡5分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉板內液體，在潔凈厚吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。

③每孔中加入HRP-抗體工作液100 μL，混勻，酶標板覆膜并置于37℃孵育30分鐘。

④洗滌：用洗滌液洗板3次，每次洗滌5-10分鐘。

⑤每孔加底物顯色工作液（TMB）100 μL，酶標板覆膜并置于37℃條件下孵育10分鐘。

提示：

1）推薦使用排槍及加樣槽加入顯色液及終止液，盡量縮小由于加樣時差造成的顯色差異。

2）根據實際顯色情況酌情縮短或延長，顯色時間在5-30分鐘范圍內。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止。

⑥每孔加終止液50 μL，終止反應，室溫放置1分鐘。

提示: 終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍槍頭切不要接觸孔內溶液以避免污染，影響實驗結果。

⑦用酶標儀在450 nm波長（參考波長650nm）測量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。

提示: 請提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置檢測程序。

 

9.結果判斷

①計算每組復孔的平均OD值。每個標準品的平均OD值減去空白孔的OD值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標（X），OD值為縱坐標（Y），繪出標準曲線（作圖時亦可去掉空白組的值）。

②推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（請使用Logistic五參數擬合曲線計算方法繪制標準曲線）等。

③若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測。

④典型數據

由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等），標準曲線的OD值會有所差異。以下數據和曲線僅供參考實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

 

X-濃度（ng/mL）	10	5	2.5	1.25	0.625	0.312	0.156	0
Y-OD450/650 nm	1.601	1.454	1.231	0.872	0.624	0.382	0.244	0.057
Y-OD450/650 nm （去本底）	1.574	1.397	1.174	0.815	0.567	0.325	0.187	0
回收量 （ng/mL）	10.167	4.822	2.628	1.182	0.657	0.306	0.153	—
回收率%	101.7	96.4	105.1	94.6	105.1	98.1	98.1	—

 

  

 

10.注意事項

1.儲存：試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發和微生物污染，否則可能會出現錯誤結果。

酶標板、標記抗體、TMB底物應始終在-20℃保存，隨用隨取，無需平衡。

2.酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F象，不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用板條應拆下后放入備用自封袋，按推薦溫度存放。

3.加樣：加樣和加同一試劑時，第一孔與最后孔之間加樣時間間隔過大將導致不同的“預溫育”時間，從而明顯的影響到測量值的準確性及重復性，每次的加樣時間最好控制在10分鐘之內，推薦設置復孔。

4.溫育：為防止樣品蒸發，實驗時必須給酶標板覆膜，洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態。嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.洗板：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙或干布上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。讀數前要清除酶標板底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀的讀數。

6.試劑配制：試劑盒在運輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用1000轉/分離心一分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。所有試劑請按說明書指示請精確配制。

7.顯色時間的控制：加入底物后，請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔五分鐘），如梯度已經很明顯，請提前加終止液終止反應，以避免顏色過深，影響酶標儀讀數。

8.底物：請避光保存底物。在儲存和溫育時，避免強光直接照射。

9.混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器，使用最低頻率，如無微量振蕩器，可以在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

提示：不同批號的試劑盒組分不能混用（洗滌液和終止液除外）。

10.關于樣品回收率

1）本試劑盒以測定重組豬胰蛋白酶的抗原性而非活力來推測殘留量，因此試劑盒中標準品采用胰蛋白酶的消光系數（E1%1cm=13.6D, 即當A280nm=1.36時，胰蛋白酶濃度為1mg/ml）來計算其蛋白含量，以最大限度保持質控的精確和穩定性。

2）不同計量方法以及產品純度的差別可以導致不同來源、不同批次產品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致，也會造成回收率的差異。

3）為避免上述因素影響，建議將用作回收率測試的樣品采用分光光度法（A280nm）估

算蛋白含量，再稀釋至適合的濃度用于回收率測試，盡量減少回收率的誤差。

 

11.問題分析

若實驗結果有問題，請及時對顯色結果拍照，并妥善保存未使用板條及試劑，然后聯系

技術支持。也可參考以下信息以找出原因。