重組牛腸激酶酶聯免疫吸附測定試劑盒 使用說明書(96T)K03-REK
重組牛腸激酶酶聯免疫吸附測定試劑盒
使用說明書(96T)
使用前請仔細閱讀說明書。若有任何問題,請聯系我們。
1.試劑盒用途
該試劑盒用于體外定量檢測重組牛腸激酶含量。 本試劑盒僅供研究或工業生產用。
2.試劑盒基本參數
靈敏度 = 0.102 ng/ml
檢測范圍:0.25 -16 ng/ml
特異性:可檢測重組牛腸激酶,與其它重組大腸菌表達系統相關蛋白無明顯交叉反應。
重復性:板內,板間變異系數均 < 10%。
工作時間:熟練實驗人員可在2.5小時內完成一次測定。
有效期:6個月
中文名稱 |
規格 |
保存條件 |
抗體包被的ELISA酶標板(96孔可拆卸) (MicroELISA Plate(Dismountable) |
8孔×12條 |
-20℃ |
凍干標準品(16ng/支)(A1) (Reference Standard) |
4支 |
2-8℃ |
濃縮辣根過氧化物酶化抗體 (A2) (Concentrated HRP-Detection Ab) |
1支×0.05mL |
-20℃ |
濃縮標準品 & 樣品稀釋液 & HRP-抗體稀釋液(25 X)(P1) (Concentrated Reference Standard, Sample&Concentrated HRP Ab Diluents) (25x) |
1瓶× 5 mL |
2-8℃ |
濃縮洗滌液(25 X)(P2) (Concentrated Wash Buffer) (25x) |
1瓶×40 mL |
2-8℃ |
顯色底物(TMB)(A3) (Substrate Reagent) |
5支×0.125 mL |
-20℃ 避光 |
底物稀釋液(TMB)(P3)(Substrate diluents) |
1瓶×15 mL |
2-8℃ 避光 |
反應終止液 (P4)(Stop Solution) |
1瓶×5 mL |
2-8℃ |
封板覆膜(可重復使用)(Plate Sealer,reuseble) |
5張 |
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產品說明書(User Manual) |
1份 |
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質檢報告(Certificate of Analysis) |
1份 |
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3.試劑盒組成及保存
未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒,請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。
酶標板和標記抗體(A2)置于-20℃保存,隨用隨取,切勿平衡。
說明:
1.所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染。
2.酶標板-20℃可存放6個月,2-8℃存放勿超過一周。
4.試驗所需自備物品
1.酶標儀(濾光片波長450 nm和650nm)
2.高精度移液器,EP管及一次性吸頭
3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水
4.吸水紙
5.待測樣品注意事項
1.樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于2-8℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內檢測),或 -80℃(3個月內檢測),避免反復凍融。
2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍,如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值,請根據實際情況,做適當倍數稀釋后再測。
3.若使用化學裂解液制備的樣本或細胞提取液,由于引入某些化學物質可能會導致ELISA測值出現偏差。
6.檢測前準備工作
HRP標記抗體應始終置于-20℃保存,請勿室溫平衡,隨用隨取。
1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。提前15分鐘打開酶標儀預熱。
2.稀釋液配制
將濃縮標準品 & 樣品稀釋液 或 濃縮HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋(1:25)。
3.洗滌液配制
將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。
提示:從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?,F象,可用40℃水浴加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過50℃,使用時洗滌液溫度應為室溫)。請當日使用。
4.標準品配制
將標準品于1000轉/分離心1分鐘,加入標準品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標準品中,旋緊管蓋,靜置10分鐘,上下顛倒數次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為16ng/ml), 然后進行倍比稀釋(注:不要直接在反應孔中進行倍比稀釋)。使用者可以根據實驗需要稀釋所需的濃度梯度配置。建議配制成以下濃度: 16、8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/ml。
倍比稀釋方法
取7只EP管,每管中加入500 μL標準品&樣品稀釋液,從16 ng/ml的標準品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL樣品稀釋液的EP管中混勻配成8 ng/ml的標準品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。
標準品稀釋圖例(以500 μL為例)
提示:最后一管直接作為空白孔。
5.HRP標記抗體工作液配制
HRP標記抗體應始終置于-20℃保存,請勿室溫平衡,隨用隨取。實驗前請先將抗體管低速離心,以避免管壁及管蓋上殘留抗體。實驗前計算實驗所需用量(以100μL /孔計算),實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘,用抗體稀釋液將HRP-標記抗體稀釋為工作濃度(抗體:稀釋液 = 1:250)。當日使用。
6.TMB顯色工作液配制
實驗前計算實驗所需用量(以100μL /孔計算)。實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘平衡底物和緩沖液,加樣前底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度(底物:稀釋液 =1:20),現用現配。
注:底物加入顯色緩沖液混勻后,若觀察顯色液變藍切勿加樣,說明可能有污染,請更換潔凈器皿。
7.洗滌方法
1.自動洗板機:每孔加入洗滌液350 μL, 注入和吸出間隔60秒。
2.手工洗板:甩盡孔內液體,在潔凈厚吸水紙(或干布)上拍干,每孔加入洗滌液350 μL(此處也可以用潔凈洗瓶進行沖洗),浸泡5分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉板內液體,在潔凈厚吸水紙上拍干。
提示:推薦使用洗瓶沖洗。若使用排槍,加樣槽請不要與其他試劑混用,避免污染。
8.操作步驟
1.將標準品工作液依次加入到前兩列孔中,每個濃度的工作液并列加兩孔,每孔100μL。待測樣品加入到其他孔,每孔100μL,若樣本濃度高于檢測范圍,需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。
提示:加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,避免產生氣泡。加樣時間控制在10分鐘內。濃度由低到高依次加入。
2.洗滌:棄去液體,甩干,在潔凈厚吸水紙上拍干。每孔加入洗滌液350 μL,浸泡5分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉板內液體,在潔凈厚吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。
3.每孔中加入HRP-抗體工作液100 μL,混勻,酶標板覆膜并置于37℃孵育30分鐘。
4.洗滌:用洗滌液洗板3次,每次洗滌5-10分鐘。
5.每孔加底物顯色工作液(TMB)100 μL,酶標板覆膜并置于37℃條件下孵育10分鐘。
提示:
1)推薦使用排槍及加樣槽加入顯色液及終止液,盡量縮小由于加樣時差造成的顯色差異。
2)根據實際顯色情況酌情縮短或延長,顯色時間在5-30分鐘范圍內。當標準孔出現明顯梯度時,即可終止。
6.每孔加終止液50 μL,終止反應,室溫放置1分鐘。
提示: 終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍槍頭切不要接觸孔內溶液以避免污染,影響實驗結果。
7.用酶標儀在450 nm波長(參考波長650nm)測量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。
提示: 請提前打開酶標儀電源,預熱儀器,設置檢測程序。
9.結果判斷
1.計算每組復孔的平均OD值。每個標準品的平均OD值減去空白孔的OD值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標(X),OD值為縱坐標(Y),繪出標準曲線(作圖時亦可去掉空白組的值)。
2.推薦使用專業的曲線制作軟件(如curve expert 1.3或ELISA Calc等)根據實驗具體要求繪制標準曲線。
3.若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測。
4.典型數據
由于實驗操作條件的不同(如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等),標準曲線的OD值可能有所差異。本試用試劑盒提供0.25-16 ng/mL范圍的數據和曲線供參考,實驗者可根據需求在此范圍內選點建立標準曲線。
1)測定范圍0.25-16ng/mL標準曲線
X-濃度(ng/mL) |
16 |
8 |
4 |
2 |
1 |
0.5 |
0.25 |
0 |
Y-OD450/650nm |
1.613 |
1.350 |
0.955 |
0.609 |
0.342 |
0.195 |
0.134 |
0.069 |
回收量(ng/mL) |
15.89 |
8.10 |
3.92 |
2.04 |
0.99 |
0.48 |
0.26 |
— |
回收率% |
99.3 |
101.2 |
98.0 |
102.0 |
99.0 |
96.0 |
104.0 |
— |
10.注意事項
1.儲存:試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發和微生物污染,否則可能會出現錯誤的結果。
酶標板、標記抗體、TMB底物應始終在-20℃保存,隨用隨取,無需平衡。
2.酶標板:剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質,此為正?,F象,不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用板條應拆下后放入備用自封袋,按推薦溫度存放。
3.加樣:加樣和加同一試劑時,第一孔與最后孔之間加樣時間間隔過大將導致不同的“預溫育”時間,從而明顯的影響到測量值的準確性及重復性,每次的加樣時間最好控制在10分鐘之內。推薦設置復孔。
4.溫育:為防止樣品蒸發,實驗時必須給酶標板覆膜,洗板后應盡快進行下步操作,避免酶標板處于干燥狀態。嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
5.洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。在讀數前要清除酶標板底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標儀讀數。
6.試劑配制:試劑盒在運輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用1000轉/分離心一分鐘,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打4-5次,使溶液混勻。所有試劑請按說明書指示請精確配制。
7.顯色時間的控制:加入底物后,請定時觀察反應孔的顏色變化(比如每隔五分鐘),如梯度已經很明顯,請提前加終止液終止反應,以避免顏色過深,影響酶標儀讀數。
8.底物:請避光保存底物。在儲存和溫育時,避免強光直接照射。
9.混勻:充分輕微混勻對反應結果尤為重要,最好使用微量振蕩器,使用最低頻率,如無微量振蕩器,可以在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
10.不同批號的試劑盒組分不能混用(洗滌液和終止液除外)。
11.關于樣品回收率
1)本試劑盒以測定重組牛腸激酶的抗原性而非活力來推測蛋白殘留量,因此試劑盒中標準品采用重組牛腸激酶的消光系數(E1%1cm=20.01D, 即當A280nm=2.01時,牛腸激酶濃度為1mg/ml)來計算其蛋白含量,并采用內部質控以最大限度保持標準品含量的精確和恒定。
2)不同計量方法以及產品純度的差別可以導致不同來源、不同批次產品中牛腸激酶的蛋白含量不完全一致,也會造成回收率的差異。為避免上述因素影響,建議將用作回收率測試的樣品采用分光光度法(A280nm)估算蛋白含量,再稀釋至適合的濃度用于回收率測試,盡量減少回收率的誤差。
11.問題分析
若實驗結果有問題,請及時對顯色結果拍照,并妥善保存未使用板條及試劑,然后聯系技術支持。也可參考以下信息找出原因。
問題描述 |
可能原因 |
相應對策 |
標準曲線梯度差 |
吸液或加液不準 |
檢查移液器和吸頭 |
標準品稀釋不正確 |
溶解標準品時稍微旋轉瓶身,輕輕混勻使粉末完全溶解 |
|
洗滌不完全 |
保證洗滌時間和洗滌次數及每孔的加液量 |
|
顯色很弱或無色 |
溫育時間太短 |
保證充足的溫育時間 |
實驗溫度不正確 |
使用推薦的實驗溫度 |
|
試劑體積不夠或漏加 |
檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加 |
|
稀釋不正確 |
||
讀數數值低 |
酶標儀設置不正確 |
在酶標儀上檢查波長和濾光片裝置 |
提前打開酶標儀預熱 |
||
變異系數大 |
加液不正確 |
檢查加液情況 |
背景值高
|
檢測抗體的工作濃度過高 |
使用推薦的稀釋倍數 |
酶標板洗滌不完全 |
重新仔細閱讀操作步驟,保證每步清洗完全;如果用自動洗板機,請檢查所有的出口是否有堵塞;是否使用試劑盒配備的洗滌液。 |
|
洗液有污染 |
配制新鮮的洗液 |
|
靈敏度低 |
ELISA試劑盒保存不當 |
按說明書要求保存相關試劑 |
讀數前未終止 |
OD讀數前應在每孔中加入終止液 |
-
產品規格一套